Подготовка буферов
Такие факторы, как температура и концентрация, могут сильно влиять на константу кислотности буфера (pKa) и, следовательно, на диапазон рН, по которому наиболее эффективна буферная система. Тщательная подготовка буферов важна для успешных и воспроизводимых экспериментов.
Готовьте буфер при соответствующей температуре и концентрации.
Поскольку изменения температуры могут быть связаны со сдвигом константы диссоциации, буфер необходимо готовить при температуре, при которой будет проводиться эксперимент. Если последний включает изменение температуры, выберите буфер с pKa, который сохраняет свои параметры в вашем диапазоне температур.
Изменения концентрации также могут быть связаны со сдвигом диссоциации, поэтому, если вы планируете хранить буферные растворы продолжительное время, убедитесь, что уровень рН не изменился после того, как вы разбавили раствор до требуемой концентрации и уравновесили его при соответствующей температуре. Или, по крайней мере, проверьте pH после разбавления.
Правильно настройте pH системы буферов.
Многие буферные материалы поставляются в виде кристаллических кислот или оснований (например, трис-ацетатный буфер TAE). Когда эти материалы растворяются в воде, рН раствора находится не вблизи константы кислотности, а рН необходимо регулировать с использованием подходящей кислоты или основания до необходимого значения. Если кристаллический буферный материал представляет собой кислоту, то рН можно довести до желаемого значения с помощью основания, которое не будет добавлять нежелательный противоион. И наоборот, если материал является основанием, то для доведения может быть использована подходящая кислота. Примечание. Растворите кристаллическую кислоту или основание только в 60-70% от конечного желаемого объема, чтобы оставить место для объема кислоты или основания, которое вы используете для доводки рН. Вода может быть добавлена для достижения конечного желаемого объема.
Однако многие буферы получаются не путем растворения кристаллической кислоты или основания, а затем доведения рН для приближения раствора к pKa. Вместо этого буферную систему готовят путем смешивания двух компонентов, таких как свободная кислота или основание, и соли в определенных соотношениях для достижения желаемого рН. Например, 0,1 М раствор HEPES и 0,1 М раствора натриевой соли HEPES, можно смешивать, чтобы получить ряд буферов в диапазоне значений рН от 6,55 до 8,55. Буферные растворы цитрата натрия могут быть приготовлены и отрегулированы до желаемого значения кислотности путем смешивания лимонной кислоты и тринатрийцитрата.
Другие буферы получают путем смешивания буферного компонента и его конъюгатной кислоты или основания с использованием расчетов Хендерсона-Хассельбалха. Например, фосфатные буферы получают путем смешивания одноосновных и двухосновных растворов фосфата натрия в определенном соотношении. Бутановые системы на основе бикарбоната натрия производят смешиванием растворов карбоната натрия и бикарбоната натрия.
Использование и своевременное обслуживание pH-метр.
Использование измерителей рН кажется почти интуитивным; однако эти приборы должны поддерживаться надлежащим образом, а электроды очищаться и заполняться, а буферы для калибровки pH должны быть правильно подготовлены и очищены от загрязнения. При использовании измерителя кислотности очень важна температура, потому что получаемые значения могут сильно зависеть от температуры. При измерении прибор должен быть настроен на температуру окружающей среды. К сожалению, рН-метр часто является самым «заброшенным» оборудованием в лаборатории. Сохраните копию инструкций производителя для использования и убедитесь, что каждый сотрудник понимает, как использовать и поддерживать счетчик. Если рН-метр используется неправильно, то получаемые значения кислотности лабораторных буферов может быть неверным, что может негативно сказаться на результатах экспериментов.
Советы по подготовке буферов
- Проверяйте все сохраненные буферы перед использованием; если они выглядят мутными или обесцвеченными, не используйте их. Такие растворы могут иметь микробное загрязнение или могут стать химически нестабильными. Исключением является MOPS, который иногда выглядит слегка желтым.
- Создайте набор инструкций по приготовлению буферов, поскольку последние сильно влияют на повторяемость. Укажите, какую кислоту или основание использовали, и рекомендуемую концентрацию. Кроме того, не забудьте указать, в какой момент во время приготовления были сделаны измерения рН. Это особенно важно, если вы добавляете дополнительные компоненты в буфер.
- Некоторые буферные материалы не попадают в раствор легко и требуют слегка щелочной или кислотной среды, либо нагревания до их растворения.
- Некоторые буферы (например, MOPS и HEPES) не могут быть автоклавированы
- Буферы, содержащие первичные амины, такие как трис и глицин, мешают количественному анализу белков по Бредфорду.
- При работе с кислотами и основаниями надевайте защитную одежду и очки. Не нейтрализуйте сильную кислоту с сильным основанием, потому что это вызывает экзотермическую реакцию, которая может расплавить контейнер.
- Если по какой-либо причине вы используете растворитель, отличный от воды, убедитесь, что знаете, как это влияет на константу ассоциации вашего буферного агента.
- Используйте для приготовления буферов реактивы проверенных производителей, таких как Sigma-Aldrich, Panreac и Applichem.